人干扰素α—2b生产工艺的研究


;一2    。
生 物 工 程 学 报 1 ( ) 2 ~2 . 9 6 2 L :3 7 19 ,  
C i e e J u n l o   B o eh oo y hn s  o r a   f it n l g   c

z } 1      

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人干 扰素 一b生 产工艺 的研 究  2
阎玉清 王 晓 沁 

(    三 究 暗 滨 1 0 】 哈裹 五 所 尔 5 2  0。
…  

鬈 

田  ,   … 



l 摘  

要  人干 扰 紊 2  一b的赫 易 、 高教 生产工 艺研 究 , 包括 高效 率 , 小型化 的发酵 技术 , 不用  

。 单 克隆抗体 亲 和层析 的纯 化工序 . 及 大肠杆 菌表达 的 人干扰 索  2     b包涵体 蛋 白的天 然 构  型 复 性 等 问 题 .从 l L基 围工 程 大 肠 杆 菌 发 酵液 所得 l O g苗体 中得 人 干 扰 紊 a2 O OO 一b约  SO O mg,效价 为 L Ou rg ×l。 / ·设备 投资 少 ·生 产成本 低 ,产 品表 现丁高 纯度 ,高效 价 。适 宜  a 大 量 生产 .为广大 人 民群 众提供廉 价高 质量 药品 创造丁条 件 。  
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筮  

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关词 键 

生’ , . 步  于     /  
’ ’   一  

人干 扰 素 a是 目前 抗 病 毒药 物 中 临 床疗 效 显 著者 之一 , 肝 炎 、 状 疱 疹 、 宫 颈 麋  对 带 子

烂等病毒感染表现 良好 的治疗效果 。早期 ,干扰素的生产系将人 白血球 或 B细胞用病毒  诱 导 产 生 的方 法进 行 .产 量 低 ,价 格 昂 贵 ,不 能 满 足需 要 。现 在 可 以 方 便 的 利 用基 因工  程 技 术 在大 肠 杆 菌 中表 达 、 发酵 进 行 生 产 。 人干 扰 索 一a或人 干 扰 索 a2 2 一b是 由 15个 氨    6
基 酸 残基 组成 的蛋 白质 ,在 大 肠 杆 菌 中表 达 的 人 干扰 素 一b除 N 末 端 多 一 个 甲硫 氪酸  2 残 基 外 其 它 与 天 然 品 相 同 。 人干扰 素 a有 十 多 种亚 型 ,其 区别 表现 在个 别氨 基 酸 的 差 异  上 .如 人干 扰 索 a2 第 2 一a的 3位 氨基 酸 为赖 氪 酸 残 基 ,而 一b的 第 2 2 3位 为精 氨 酸 残 基  临 床应 用 的 结果 ,干扰 素 a2 一a来 自恶 性 化 细胞 系 ,临 床使 用 过 程 中产 生 中和 抗体 的频 率  为 1  .大 于来 自正常 细 胞 系 人 干 扰 索 一b的 产 生 中 和抗 体 的 频 率 为 6   7 2   。基 于上 述  原 固应 更 多 考虑 生 产使 用人干 扰 素 一b 2 。从 已发 表 的 论 文 。 透 露 的工 艺 看 来 ,表 现 在    基 因 工 程 菌 的 发 酵 水平 低 .需 要 采用 大 型发 酵 罐 设 备 投资 高 ,工 艺 中使 用 单 克 隆 抗体 亲  和 层 析 ,制 备 量 的 单 克 隆 抗 体 亲 和 层 析 柱 不 仅 价 格 昂 贵 ,而 且 使 用次 数 有 限 (0 O z ~3  次 ) 这 些 来 自鼠的 单 克 隆 抗 体蛋 白的 片段难 避 免 从 亲 和 层 析 柱 中脱落 、混 入产 品造 成 异  , 源蛋 白污 染 ,十分 危 险 。所 以随 着工 艺 的改 进 、生物 工 程 产 品 使 用 单 克 隆 抗体 亲和 层析 
工艺 已被 淘 汰 

我 们研 究 了 人干 扰 素 一b的基 因 工 程 大 肠 菌 的发 酵 , 涵 体 的 恢 复 天然 结构 以及 不  2 包

用单抗亲和 层析 的纯化等方面的工作 ,建立了简易高教的生产工艺。  

1 材 料 与 方 法 
1 1 菌 种  .

S I N口2 / HS ,质粒 用 P- 动子 ,含 氨 苄 青 霉 素 抗性 基 因 。 W F bD  ̄ - 启  
丰文于 19 9 5年 5月 1 日收 到  o

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生 

物 

工 

程 

学 

报 

1 2卷  

1 2 试 剂  .

蛋 白胨 , 母 抽 提 粉 系 英 国 Ox i 酵 od或 日本 大 五 荣 养 公 司 产 品 , E一 2为 W h t n产  D 5 a ma

品 。 e hd xG一0为 P amai 品 。葡 萄 糖 、磷 酸盐 、尿 素 、硫 酸 镁 、氯 化 钠 、氯 化  S p a e  5 h r ea产
钙 、氯 化铵 皆系 国产 品 。   1 3 蛋 白凝 胶 电 泳  . 按 Le a mmml t l 献 [ 1 报 道 的方 法 进 行 。 i   文 .e a 1]   1 4 S S P GE凝 胶 扫 描  .  D — A 用 P a ma i L h r ca K口UL O  CAN X.L. 型扫 描仪 进 行 。   TR S     1 5 蛋 白浓 度 测 定  . 以牛 血 清 白蛋 白为标 准 ,按 L wr  方 法 进 行  o y 1 6 人 干扰 素 a 2 . 一 b效价 测 定  用 连续 稀释 法 以水 泡性 口膜 炎 病 毒 ( V) 抑 制 细 胞感 染 病 变 方 法 。 VS    进 行  1 7 尿 素溶 液 的 纯化  . 按 文献 [ 4 1 ]方 法 进行 。   1 8 发 酵  . 1 8 1 种 子 培 养 液 :蛋 白胨 1g,酵 母 抽 提 粉 5 .. O g,Na 1 g C  ,加 水 至 1 0 ml 5 0 0 ,分 装 于 4  

个 10 ml 角烧 瓶 中 .10 灭菌 2mi. 却 后 取 2 加 氨 苄青 霉 素达 5v / , 种  00 三 2C 0 n 冷 瓶 0 g ml 接 人 干 扰 素 n2 一b基 因 工程 菌 ,3  ̄ 床培 养 1 h 0C摇 0 .作 为发 酵 罐种 子 使 用 。   18 2 发 酵 罐 及 培 养 液 组 成 :发 酵 罐 1L、 B B an Bo tt E 型 。培 养 液 9 .. 5 . ru  isae   L:含 
( ) 白胨 1 0 酵母 抽 提 粉 5 , g 蛋 0, 0 NH    , C  , 2 O。 0 C C  . , CI Na I NaHP 6 , a I0 1 KH2 O。0  1 5 2   P 3,

M g O  S 1和 少 量 防 泡 剂 在 10C灭 菌 2 mi ,冷 却至 3 "  " 2 0 n后 0 C,外 加 单 独 灭 菌 的 含 葡 萄 糖  溶液 4g 0 ,氨 苄 青 霉 素 0 5 .g,接 种 种子 培养 液 5 0 进 行 发 酵  0ml 18 3 发 酵 参 数 :p . ;搅 拌 转速 5 0/ n;温度 3 ℃/ z ;通 气量 1L mi .. H6 8 0 rmi o 4℃ 0 / n;溶 
氧 5  O

2 结果 和 讨 论 
2 1 发 酵 及 细 胞 破 碎  . 用 1L B ru 发 酵罐 盛 1L发 酵 液  5   .B a m 0 进 行 发 酵 ,按 材 料 与 方 法 所 述 参 数 进 行 ,于 
3 ℃发 酵 8 然 后 4 ℃诱 导 2 0 h, 2 h完 成 发 酵 。 每 

隔 不 同 时 间 取 2 发 酵 液 ,1 0 rmi ml 00 0/ n离  L除 去 上清 液 ,秤 量 菌 体 湿 重 ( 量 菌 体 重  - 秤
量 比测 定 发 酵液 浊度 更 为 准 确 ) 结 果 如 图 1 ,  
所示 。  
‘  

? h I  I   

发 酵  毕  却 后 用 40rmi 离 心  t I 0   日 完二 冷 于 FT   , 口   f 0/ d / L  
.  

图 1 人干扰素 a2 基困工程苗的发酵 一b (ek n f B e ma J B离 - L , 0 n, 去上 清液 ,  ̄ ) 3 mi 除 g   Fg     Fm m    p      _ “ r。j 得 湿 苗 体 l g左 右 ,破碎 细胞 4 ℃诱 导 不  e 。 咖 。 。     b    “ k 2


P 。 。 邮  f 。   p rd   m  e “。     n   

同 时 间 后人 干 扰 素 。2 b的表 达 量 如 表 1 结 


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1期 

阎玉清 等 :^干扰 素 一b生产 的工艺 的 研究  2

果 表 明诱 导 2 3 ~ h即可 。  
表 1 诱导 时间 对于抗 素表 达水 平的影 响 
Ta l     Ef e t o   hei d c o   i eon t e e p e son l v l  n e f r n a一 b b e1 f c   f t  n u t n tm     h   x r s i  e e  i t r e o   2   i of
I du to   i e/   n c i n tm h Exp e s o   e e  r s in lv l i t r e on Ⅱ 2   nefr b

2 2 产 物 的 抽 提 复 性 与 纯化 回收   
1 t I  

¨ , , /  

取 lO O g湿 重 细 胞悬 浮 于 5 0   H7 0 0 0 ml p . ,2 mmo / [L磷 酸 缓 冲液 中 ,于 冰 浴 条 件 下 进 

行 超 声 破 碎 ,超 声 发 生仪 为 L b o i,10 20 a snc 7 W/ 0 V,反 复 进 行 3次 ,用 B c ma  6 ek nJ B离 
心 机 4O 0 / n离心 3 mi 。取 沉 淀 部分 用 1 0   mo/   0 r mi 0 n 0 ml 8 lL尿 素溶 液 ,p . ,2 mmo/ H7 0 0 [ 

L磷 酸 缓 冲液 ,0 5 . mmo/ lL二 琉 基 苏 糖醇 室 温 搅 拌 抽 提 2 ,用 B cma 22M 离 心 机  h ek nJ— 1 (50 0/ i)离 心 3mi。取 上 清 液 用 同 样缓 冲液 稀 释 至 尿 素 浓度 为 0 5 lL,加 二  1  0rr n a 0 n . mo/ 巯基苏糖醇至 0 1 . mmo儿 ,C l C搅拌 1h,1 0 rmi 心 3 ml 去 不 溶 物 。经 截 留  5 5O 0 / n离 0 n除
量 1  0 00 0分 子 量 的 中空 纤 维 超 滤器 浓 缩 , 浓缩 的 I  一 b溶 液 经 过 s p a e     0分  将 NF 2 e h d xG 5 离 ,层 析 柱 2 m×1 0 r ,先 用 2 mmo/ c 0e a 0 [L,p . H7 0磷 酸缓 冲液 平 衡 ,上 柱 后 用 同一 缓 冲 

液 洗 脱 分 离 ,收 集 I a2 NF  b部分 ,经 S — AGE检 查 。将 S p a e  5 DSP c h dxG一0柱 层 分 离 的 
I a2 NF   b组 份 ,再 经 DE 5 一 2柱 (c 2m×5 c 0m)纯 化 I N  一 b 2 ,上 柱 后 用 含 0 0 、0 1和  .5 . 0 1 to/   C 的 2 mmo /   H7 0磷 酸 缓 冲液 洗 涤 ,收 集 含 I F 2 . 5 lL Na [ o 0 iL p . N  一 b的洗 脱液 。垒 

过 程 蛋 白 质 回收 率 为 2  ~ 2  ,产 品不 舍 杂 蛋 白 ,DNA 及热 源物 质含 量 台 格 。 O 5   产 品 的 HP C 分 析 , 价 及 扩 大 生 产结 果 列 于 图 2及 表 2 L 效 、表 3 说 明本 文 报 道 的 生  ,
产 工 艺 是 简 易而 高 效 的 。  
表 2 I   NFa 曲 的生 物活性  一
Ta e 2 Bi ogcala l ty bl    ol i   ctv t   I F  2b N a·  

Bi l j I t ; 。 og      t  
Ba c   th

/U × 1 [ 0。·mg  
2 5  O  

0 7 8 . 0  1 7 .  l 5  l   l     67

oo . 

o5   

1  

15   

2o   

15   

30 . 

35 .  

4  

目前 ,外 源 基 因 用大 肠 杆 菌 表 达 时常 

图 2 人干 扰素 一b产品的 HP C分析  2 L
Fi  2 H P g   LC  na y i  fI e f r n a l ss o  nt r e o   2   b
Sh m a z   i d u SPD 一 A V . R P C一    4 c × 2 c   3   6   80 6m 5m 0

用P L启动 子 ,因 为诱 导 表 达 比较 方 便 , 在 
3 ℃条 件 下 发 酵 生 长 , 后 在 4 ℃进 行 诱  O 然 2

CH3 CN   1 0  

T rfu o a e i  c d, 0 5 /   . il or   c tc a i . ml mi   n

导表达 , 诱导表达时细胞应在存 活状 态 , 所 

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l 2卷 

以 3 c生长过程时间不宜过长 ,由于生 长温度低 、时间短 ,所以一般情 况下发酵 的菌体  0
收 量不 高 , 们 使 用 1L 发酵 罐 盛 IL发酵 液 , lb操 作 过 程 中 可 得 湿 苗 体 I g左 右 , 我 5 O 在 o k   不 仅 能 稿 足 下 游批 量生 产 需 要 , 且 不 需 要 另外设 置锅 炉 和 泵 房 , 发 酵 车 间 小 型 化 、 而 使 节 
约 投 资 , 肄有重 要 经 济意 义 。表 达 产 物形 成 包 涵 体 ,优 点 在 于 表 达 产物 稳 定 、 量 多 ,缺 

点是 恢 复 蛋 白质 的 天 然 结构 才能 充分 地 显示 生物 活力 。  
表 3 3批 扩 大 实 验 结 果    
Ta e 3 S l —   o  o c on bl    ca e up t pr du t   i

不 同蛋 白质 从 包 涵 体恢 复其 天 然 结构 的 方法 不尽 相 同 ,与 该蛋 白的 分 子 量 太 小 .二  硫 键 多 少 ,有 否 亚 基存 在等 都有 密切 的关 系 。有 很 多 蛋 白 只能 部 分 恢 复 其 生 物 活 力 ,我 
们研 究 了 ^干 扰 素 。 2 一b的 从 包涵 体恢 复 天 然 结 构 与 活 力 的 关 系 ,很 多 因 素 影 响 这 一 过  程 . 但从 理 论 上还 有 许 多待 研 究之 处 。   纯 化 干 扰 索 。所 使 用的 单 克 隆 抗 体 层 析 柱 一 般 常 用 C r活化 S p ao e联 结 抗 体  NB e h rs

蛋 白 ,在 解 离 抗 原一 体 结 台时 所 使 用 的 p 很 低 ,不仅 容 易 引起 产物 失 活 ( 抗 H 人干 扰 素 n  一 2 b对 酸性 p 还 比较 稳 定 )还 会 l H 起抗 体 片段 的 脱 落 , I 异 源 蛋 白的污 染 ,所 以 目前    起 生 物 工 程产 品工 序 中不 得 使 用 .本 文 符 合不 使 用抗 体 亲 和 层析 要求 。   全过 程 中 J干 扰 索 a2 、 一b蛋 白回 收 率 为 2  ~2  左右 , 列 出每步 的 活 力 回收 , 0 5 未 因 
为 ^ 干 扰 素 。2 一 b复性 前后 生物 活 力相差 百 倍 之 多 ,这 种 计算 无 意 义 。   参
r: 1  … … F, An o e l  , Cu r nf M   t n ie G re i  





献 

a   J I    , l 90| l ( P l   NF Re 9 0 Su P) S6  .

: ] 格  2

. 金 冬 耀 ,盘

奇等
园等

南 毒 学 报   19 9 2.3 ‘ ) ∞ 5 2 9  3  ~ 0.
病 毒 学 报 ,l 9 .s ( ) 2 ~ 3 1 9Z 4 :3 7 3  

[ ] 陈 晓 燕 .禁 盂枫 .厨 3

[ 康 厩先 .叶   r  祷   5
s  ]

勤  俞 倥 掌 等 . 生 物 工 程 学 报 .1 9 , 9 ( ) 3 2 3 6  93 4 : 3 ~ 3. 固 , 车 玉 茧 等 . 病 毒 学 掘 , 19 ,7 ‘ ) l 2 1 7  l 2 : 4~ 4 .   宿 毒 学 报 , l 9 , 1 ( ) 1 1 17  95 1 2 : 3 ~ 3. : 上  市 生 { 学  螭 , 上 海 生 奄 {学 学 木 告 议 论 文 摘 要  1 4   6     1  朝 ,p 0

刚 ,屙

园  盅 年 雁 .强 智 情 等 . 宿 毒学 报 . 19 9 3,9 ( ) 3 ~ 9 1  7 .  

]张

彤 .呈 赦 华 . 张 鹤 舯

r 诛 平 武 . 王 晶 伦  陆 德 细 . ∞  
:  : T竹 … [∞ J

  lS  . Roy S K , Li t k R A  M e o   i   a k  T    pu    t d n En ymol y, 1 8 0 9 6, l 9: 1 3~ 1 5 1 5 6 

Th w h r D  . Pa a ot v   a e  R n y [ N N  M e h d   En ymo o yl 1 86 11 i t o s m  a lg   9 ,   9: l 6 1 7  6~ 7.

j ] La m] U  j m i K  N t T   -u e. 1 7   2 7- 鼬 0 68     90 2 ~ 5 £ 2 Lu y O H , Ro e r u -N  F¨rA  1: wr s b o 日l J. r   L  al J olCh m , 1 5       e 9 1. 1 3: 2 5 9 6 

f ] Ru s en P, Fa i ti , Sin y P K  JViol y. 1 81 37; 7 5~ 7 8  l3 bit i  m Iet C I   d e      r og 9 , 5 5.
[ 4] Pr k s   1 a a h V  L l h ux C. St p n A r h  ̄ op y Bi c m  l 8     e   e he . c h   o he 9 1. 1l 0: 4 5~ 4 5 64
. 

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1期 

阎 玉清等 :』干 扰索 a2 、 一b生产 的工艺 的研 究 

  he Pr duc i   f I e f r n 0一 b t on o   nt r e o   c2   S udy on t   o t


Exp e s d i   c e i h a c l  r s e   n Es h r c i   o i

Ya   qn W a g Xio l  n Yu i  n   a qn
( a b n P h m a e tr 2 I si u e H r i   ar c u ia   n tt t   i a H a b n 5 0 0) n   r i 1 0 2  

W u A ih n S n Y u u     ze  u   k n
( h h a  s c   e tro   oeb oo y-Ac d mi a s ia S a gh i 0 2 3  S a  i Ree h C ne  f Bi c a lg a t a e n i c  h n a  0 3 ) n 2

Ab t a t src 

Th   r d c i n p o e s o   n e f r   一 b wa   s a l h d i   u   a tt t . e p o u t   r c s   f i t re on o 2   s e t b i e   n o r i s iu e  s

Th   u e h ma   n e f r n 口 2   s e p e s d i   n i t re o 一 b wa   x r s e   n E.c l b   s n   o i y u i g P【p o o e ,Th   r d c    rm tr ep o u—

t n p o e sc n it  fh g   eld n iy f r n a i n, r | l ig o  h  n l so   o y· i   r c s  o ss so  ih c l e st  e me t t o   o eo d n   ft ei cu in b d  
c r ma o r p y wih S p a e   5   n   ho t g a h   t   e h d x G一 0 a d DEAE , wih u   s n   o o l n n   n i o y t o tu i g m n c o i g a tb d  

a f iy c o a o r p y Afe  u iia i n, b u   0 m go   t re o   一 b wa   b an d fi t  hr m t g a h . t rp rfc to a o t5 0 n   f n e f r na 2   so t ie   i
fom  k   tc i p o u e   y 1 L f r n a i n b o h Th   i l g c l c i i   h ws 1 r l g we   e l r d c d b   O   e me t to   r t .   e b o o ia   tv t s o    a y


2× 1   U/   r t i. Th sp o u to   o e si  e y smpe a d c n e int I  l 0 I mg p o en i r d c in pr c s s v r   i l  n   o v ne . twi    l

s v    o   f fcl y iv sm e t s a e a d lb u a e a l to  a i t  n e t n . p c   n   a o r, s  ha  h   O to   h   r d c  s i o t tt e c S  ft e p o u t i 
rt a her 【 w . o  

Ke   o d   H u a   n e f r n 一 b yw rs m n it re o   2  


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