干扰素的功能和制备方法


生物学教学

2010 年 (第 35 卷 ) 第 1 期

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干扰素的功能和制备方法
谭  云  (广东省佛山市第一中学  528200)
摘  要  干扰素是受感染的宿主细胞产生的一类具有广泛生物学功能的糖蛋白 ,其制品广泛应用于临床 。本文从干扰素的种类 、 功能和制备方法等方面作一简述 。 关键词   干扰素   功能   制备方法

  人教版高中《 生物 》 选修 3 专题 1 “ 基因工程的应 用” 一节中 ,介绍干扰素是动物或人体细胞受到病毒侵 扰后产生的一种糖蛋白 , 可利用基因工程的方法在大 肠杆菌及酵母菌中获得 。那么 , 大肠杆菌为什么能用 于生产人的干扰素呢 ? 干扰素是什么样的物质 ? 又是 如何利用基因工程技术制备的呢 ?
1  干扰素简介 1. 1   干扰素的发现   早在 20 世纪 30 年代 , 人们就知

在 ,因此干扰素的作用范围非常广泛

[ 1, 2 ]



干扰素仅作用于异常细胞 , 对正常细胞的作用很 小 ,而且有较严格的种属特异性 ,即一种生物产生的干 扰素只作用于同种生物细胞 ,使其获得保护力 。
1. 3  干扰素的种类  干扰素是由多种细胞产生的一

组可溶性分泌型糖蛋白 。根据产生细胞 、 受体和活性 等因素将干扰素分为 Ⅰ型 、 Ⅱ型两种类型 ; 按生产途 径 ,将用人血细胞生产的干扰素称为天然干扰素 , 用基 因重组技术生产的称为重组型干扰素 。
1. 3. 1  Ⅰ 型干扰素   又称抗病毒干扰素 , 主要参与抗

道病毒之间存在干扰现象 。 1957 年英国科学家 Isaacs 和 L indenmann 发现当细胞感染了一种病毒后 , 能产生 一种物质作用于其他细胞 , 使机体对抗原上无相关性 的其他病毒产生抵抗 , 因而将这种物质命名为干扰素
( IFN )
[1 ]

β型和 ω 型等亚型 。人的 病毒 、 抗肿瘤 。分为 α型 、 IFN - α 、 IFN - β和 IFN - ω基因位于 9 号染色体 ,无内 含子 。 IFN - α主要由白细胞产生 , 由 166 ~172 个氨 基酸组成 , 无糖基 , 分子量约为 18. 2kD; IFN - β可由 几乎所有的有核细胞产生 ,分子含 166 个氨基酸 , 有糖 [1 ] 基 ,相对分子质量为 20kD ; IFN - ω主要由白细胞产 生 ,是由 172 个氨基酸组成的糖蛋白 。三种亚型的受 体为同一种分子 ,与 Ⅱ 型的受体不同
[2 ]



1. 2   干扰素的功能   后来研究发现 , 干扰素系统是动

物细胞普遍存在的一种防御系统 , 约 5 亿 ~10 亿年前 就存在于细胞中 。正常情况下 , 细胞并不自发产生干 扰素 ,组织和血清中也不含干扰素 。这是因为细胞中 存在 IFN 基因抑制物 , 与 IFN 基因结合后使其处于抑 制状态
[1 ]



。能诱导 IFN 的物质称为诱生剂 , 主要包括

1. 3. 2  Ⅱ 型干扰素   又称免疫干扰素 , 主要参与诱导 MHC Ⅱ 类抗原的表达 , 在增强机体免疫调节能力方面

病毒 、 细菌等病原微生物 、 细菌脂多糖 、 多核苷酸 、 有丝 分裂原等 。当这些诱生剂作用于细胞膜后 , IFN 基因 解除抑制 ,细胞开始合成干扰素 ,并分泌到细胞外 。 干扰素具有广泛的抗病毒 、 抗肿瘤和免疫调节作 用 ,但并不是直接起作用 ,而是与细胞膜上的特异性受 体结合 ,引发一系列特定的生化反应 , 诱导产生特异性 蛋白质和酶 。这些物质能抑制病毒基因的复制和转 录 ,降解病毒 mRNA , 从而抑制病毒的增殖 ; 能促使肿 瘤细胞溶解 ,并改变肿瘤细胞表面的性质 , 使之容易被 免疫细胞辨认并消灭 ; 能增强 B 细胞 、 T 细胞活性 , 促 进吞噬细胞的吞噬作用 , 增强机体免疫应答能力 。干 扰素的受体分布广泛 , 几乎所有的有核细胞 表面 都 存
[ 3 ]陈建秀 ,麻智春 ,严海娟 ,等 . 2007. 跳虫在土壤生态系统中的作

有明显效果 。只有一种 IFN - γ, 基因位于 12 号染色 体 ,包括 3 个内含子和 4 个外显子 。 IFN - γ主要由 T 细胞产生 ,成熟分子是由 143 个氨基酸组成的糖蛋白 , 以二聚体或四聚体形式存在
[ 1, 3 ]



2003 年又发现一组新型干扰素 IFN - γs, 包括 3

种亚型 IFN - γ1、 IFN - γ 2 和 IFN - γ3, 具有与 Ⅰ型干 扰素相似的生物学活性以及信号转导通路 , 但受体 与 Ⅰ型不同 。基因位于 19 号染色体 , 有 5 ~6 个外显 子
[4 ]

, 目前临床上作为 Ⅰ型干扰素的辅助及替代治

疗。
2  干扰素的生产制备方法

干扰素的生产方法主要有两种 : 生物来源提取法 和基因重组技术法 ,前者是早期干扰素的生产方法 。
2. 1  生物来源提取法  天然干扰素需要培养人外周
用 . 生物多样性 , 15 ( 2) : 154 ~161
[ 4 ] Nardi F, Sp insanti G, Boore JL, et al . 2003. Hexapod origins: monophyletic or paraphyletic? Science, 299, 1887 ~1889 [ 5 ] Christiansen KA , Bellinger P. 2003. Collembola ( Sp ringtails, Snow Fleas) , Encyclopedia of Insects, Elsevier Science ( USA ) , 235 ~ 239

血细胞 ,用病毒诱导干扰素分泌 , 然后将培养物离心 、 分离获得上清液 , 再经过纯化制得 。这种方法得到的 干扰素具有天然的分子结构和生物活性 , 但是成本太 高 ,难以大规模生产 。

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2. 2  基因工程提取法  由于天然干扰素在应用中的

加工和修饰过程 ,包括糖基化 、 磷酸化 、 酰胺化 , 以及经 蛋白酶水解后转变为活性形式 , 产生的外源蛋白质更 接近人的天然蛋白质 , 通过分离步骤即可获得重组蛋 白质 ,从活性方面比较远胜于酵母表达系统
[5 ]

限制 , 20 世纪 70 年代起科学家开始探索干扰素的基因 工程生产 , 目前是生产干扰素的主要方法 , IFN - α 、
IFN - β和 IFN - γ都有基因工程产品
[5 ]

。与血源性干

。缺点

扰素相比 , 具有无污染 、 安全性高 、 纯度高 、 生物活性 高、 成本低等优点 , 从而进入大规模的产业化生产阶 段 ,并广泛应用于临床 ,目前已成为当代生物技术药品 中 ,在临床及研究中应用最广泛的细胞激活素 。 基因工程药物的生产过程包括 : 鉴定有药物作用 的目的蛋白 ; 分离或合成编码该蛋白的目的基因 ; 连接 合适的载体 ,导入宿主细胞 ; 构建高效表达的工程菌或 细胞库 ; 用发酵罐或生物反应器大量生产目的蛋白 ; 分 离纯化目的蛋白 。 获得目的基因的方法有多种 , 如 Ⅰ型干扰素的基 因无内含子 , 可提取人基因组 DNA , 以 DNA 为模板 ,
PCR 扩增成熟肽的编码序列 ; 有内含子的基因 , 如 IFN - λ,可用病毒诱导人细胞 , 采用 RT - PCR (反转录 —

是需要昂贵的培养基 , 复杂的培养条件 、 仪器和设备 , 培养周期长 、 产量低 、 易污染 、 产物不易纯化 、 操作繁 琐、 自动 化 水 平 低 , 因 而 难 以 满 足 大 规 模 的 实 际 应 用
[ 4, 5 ]



3. 3  大肠杆菌表达系统  大肠杆菌一直是应用最广

泛 ,也是最有效的表达重组蛋白的工程菌 , 具有生长迅 速 ,能在便宜的培养基中生长 、 易于操作 、 表达高效而 稳定等优点 ,同时也是目前遗传和生化背景研究得最 清晰的生物之一 ,便于遗传学改造 。 研究发现虽然天然的干扰素为糖蛋白 , 但糖基对 于干扰素的结构和生物学功能不是必须的 , 大肠杆菌 生产的 IFN - γ与天然 IFN - γ相比 , 具有完全的抗病 毒能力 ,在人体内的生物效应 , 两者相比没有显著差 [3 ] 异 。甚至除去了糖基的 IFN - ω活性更高于糖基化 的 IFN - ω 。而大肠杆菌缺乏蛋白质修饰的问题也 有其他解决途径 , 如 20 世纪 70 年代后期发展起来的 一种聚乙二醇修饰法 , 将活化的聚乙二醇与蛋白分子 偶联 ,能代替天然蛋白质的糖链作用 , 例如使化学稳定 性增加 ,抵抗蛋白酶水解能力提高 ,免疫原性和毒性降 低 ,体内半衰期延长 , 血清的清除率降低 得大肠杆菌表达系统的应用更加广泛 。 该表达系统产生的外源蛋白 , 常以不溶于水 、 无活 性的包涵体形式存在 ,必须进行蛋白质的复性等工作 , 以恢复天然构象和生物活性 。但对于生物制药来说 , 包涵体也有一些优点 ,如富集目的蛋白 , 杂蛋白含量较 低 ,便于分离和纯化 ; 抗蛋白酶的降解 ; 对宿主菌毒性 小 。因此只要能够成功复性 , 该表达系统是大量生产 重组干扰素的有效的途径
主要参考文献
[ 1 ]王晓丽 ,王永明 . 2008. 干扰素研究进展 . 动物医学进展 . 29 ( 12) : 60 ~63 [ 2 ]左爱军 ,梁东春 . 2006. 重组人 ω - 干扰素的制备及活性分析 . 中
[ 2, 5 ] [6 ] [2 ]

聚合酶链式反应法 ) , 先提取总 RNA, 反转录得到 cD 2
NA ,再以其为模板 ,进行聚合酶链式反应 , 利用引物扩

增目的基因

[4 ]

; 对于已知序列的基因 , 还可以人工合

成 ,但是在合成过程中 ,发生错误的几率会随着链的延 长而增加 ,并且费用较高 。获得目的基因后 , 就可以导 入合适的工程菌或细胞表达 。
3  干扰素表达系统

, 这些都使

干扰素的表达系统有原核生物表达系统和真核生 物表达系统 ,前者主要是大肠杆菌 , 后者有酵母菌 、 哺 乳动物细胞等 。
3. 1   酵母菌表达系统   酵母菌是一种低等真核生物 ,

既有操作简易 、 易于培养 、 生长迅速 、 成本低等优点 , 也 具有翻译后修饰过程 , 可完成糖基化 、 蛋白磷酸化等过 程 。目的蛋白以天然可溶性形式表达 , 并分泌到细胞 外 ,具有很好的生物活性 ,也避免了原核表达系统中包 涵体溶解 、 复性过程中出现的活性下降等问题 。 早期应用酿酒酵母 , 由于存在一些缺陷 , 目前主要 使用巴斯德毕赤酵母 ( P ichia pastoris) 。这种酵母在 20 世纪 80 年代被开发出来 ,大约已有 200 多种外源蛋白 成功表达 。优点是自身分泌的蛋白较少 , 易分离 、 提 纯 ,其中一种 S MD1168 菌株是蛋白酶缺陷型 , 能避免 目的蛋白被降解
[6]



国免疫学杂志 . 10 ( 22) : 940 ~943
[ 3 ]李   岩 ,邵念鹏 . 2001. γ - 干扰素的研究与临床应用 . 河北省科

。缺点是分泌物不均一 , 发酵周期

学院学报 . 3 ( 18) : 174 ~178
[ 4 ]严玉兰 ,刘   洋 . 2008. 人 λ - 干扰素在 BHK - 21 中的表达及生

长 ,易污染 ,并且长时间发酵不利于目的蛋白的表达 , 筛选产物的过程成本太高 。此外 , 还存在糖基化异位 现象 ,有时无法正确表达目的蛋白 。而且毕赤酵母的 分子生物学研究基础差 , 进行遗传学改造的难度较 大
[ 5, 6 ]

物学活性的研究 . 细胞与分子免疫学杂志 . 24 ( 10) : 950 ~953
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的表达 . 中国生物工程杂志 . 25 ( 12) : 45 ~49

3. 2  哺乳动物表达系统  哺乳动物细胞具有翻译后


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