干扰素生产工艺


重组人干扰素生产工艺

主要内容
干扰素概述 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏 干扰素的发酵工艺过程 干扰素的分离纯化工艺过程

1 .干扰素概述 .干扰素概述
干扰素的种类 干扰素的理化性质 干扰素的生物学活性 干扰素的临床应用 干扰素的生产工艺路线

1.1 干扰素的种类
概念: interferon,IFN) 概念: (interferon,IFN)

干扰素是一种细胞因子,它是机体感染病毒时,宿主 细胞通过抗病毒应答反应,而产生的一组结构类似、 功能相近的低分子糖蛋白。英文名称为Interferon,简称 功能相近的低分子糖蛋白。英文名称为Interferon,简称 IFN。 IFN。 发现:干扰素是1957年英国科学家Isaccs等 发现:干扰素是1957年英国科学家Isaccs等发现的。他们把 灭活的流感病毒作用于小鸡细胞,结果发现这些细胞 产生了一种可溶性物质,这种物质能抑制流感病毒, 并且能干扰其它病毒的繁殖,因此,他们将这种物质 称为“干扰素” 称为“干扰素”。以后科学家们进一步发现,机体对 入侵的异种核酸(包括病毒)都产生干扰素以进行防 御。当机体细胞受到病毒感染时,机体细胞产生干扰 素,干扰病毒复制,它是机体抗病毒感染的防御系 统。

天然干扰素分类
1. 根据来源、 根据来源、基因序列和氨基酸组成分类 I 型干扰素: IFNα、IFNβ、IFN τ、IFN ω 型干扰素: IFNα、IFNβ、 τ、 来源:白细胞、成纤维细胞、 来源:白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等 抗病毒感染、 功能 :抗病毒感染、抗肿瘤生长 免疫调节(较弱) 免疫调节(较弱) 其中IFN- 为多基因产物,有23种以上的亚型。 其中IFN-α为多基因产物,有23种以上的亚型。

II 型干扰素:干扰素γ(IFNγ) 型干扰素:干扰素γ IFNγ 来源:活化的T细胞和NK细胞产生 来源:活化的T细胞和NK细胞产生 功能: 功能:免疫调节 提高单核巨噬细胞、 提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 增强Tc细胞和 细胞的杀伤活性 细胞和NK 增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性 抑制TH2细胞形成 细胞形成, 抑制TH2细胞形成,下调体液免疫应答 趋化作用 抗病毒和抗肿瘤作用(次要) 抗病毒和抗肿瘤作用(次要) 2. 根据动物来源确定分类,例如人干扰素(HuIFN),小鼠干扰素 根据动物来源确定分类,例如人干扰素(HuIFN), ),小鼠干扰素 MuIFN)。 (MuIFN)。

上市重组干扰素: α2a、α2b、α1b、 β1b, 上市重组干扰素: α2a、α2b、α1b、 β1b,γ

1992年我国第一个基因工程药物IFN-α1b获 1992年我国第一个基因工程药物IFN-α1b获 得国家一类新药证书。 研发中的重组干扰素: 研发中的重组干扰素:IFN ω,临床阶段 ω,临床阶段

1.2干扰素的理化性质 1.2干扰素的理化性质
143-166aa; MW:18-40 ku; pI: 6.5-7.5; 乙醚、氯仿敏感 容易吸附玻璃、淀粉、醋酸 纤维膜、琼脂和塑料等介质。

1.3干扰素的生物学活性 1.3干扰素的生物学活性
正常情况下组织或血清中不含干扰素,只有在某些特定因素的作 用下才能诱使细胞产生干扰素。

1.3.1广谱抗病毒活性机制 广谱抗病毒活性机制
Ⅰ型干扰素具有广谱的抗病毒活性,对多种病毒如DNA病毒和 型干扰素具有广谱的抗病毒活性,对多种病毒如DNA病毒和 RNA病毒均有抑制作用;但这种效应不是直接的,而是通过对 RNA病毒均有抑制作用;但这种效应不是直接的,而是通过对 宿主细胞的作用引起的。 ①对干扰素敏感的细胞表面存在于干扰素受体,核内有“ ①对干扰素敏感的细胞表面存在于干扰素受体,核内有“抗病毒 蛋白” 蛋白”基因,受干扰素作用后该基因活化,产生的抗病毒蛋白 可阻止病毒mRNA翻译,并促进病毒mRNA降解。 可阻止病毒mRNA翻译,并促进病毒mRNA降解。 ②干扰素能提高细胞表面MHCⅠ ②干扰素能提高细胞表面MHCⅠ类分子的表达水平,受到病毒感 染的细胞表面MHCⅠ类分子的增加有助于向Tc细胞递呈抗原, 染的细胞表面MHCⅠ类分子的增加有助于向Tc细胞递呈抗原, 引起靶细胞的溶解。 ③干扰素可增强NK细胞对病毒感染的杀伤能力。 ③干扰素可增强NK细胞对病毒感染的杀伤能力。

病毒复制

抑制病 毒复制 IFN-诱导蛋白 诱导蛋白

诱导刺激 胞核

信号转导 胞核

IFN-α α

抗肿瘤作用机制
Ⅰ型干扰素能抑制细胞的DNA合成,减慢细胞 型干扰素能抑制细胞的DNA合成,减慢细胞 的有丝分裂速度;这种抑制作用有明显的选择 性,对肿瘤细胞的作用比对正常细胞的作用强 500~1000倍。另外,Ⅱ 500~1000倍。另外,Ⅱ型干扰素也可通过增 强机体免疫机制、加强免疫监督功能来实现其 抗肿瘤效应。

免疫调节活性机制
免疫调节作用表现在对宿主免疫细胞活性的影响,如对巨噬细胞、T细胞、B细胞和 免疫调节作用表现在对宿主免疫细胞活性的影响,如对巨噬细胞、T细胞、B NK细胞等均有一定作用。 NK细胞等均有一定作用。 对巨噬细胞的作用:IFNγ可使巨噬细胞表面MHCⅡ 对巨噬细胞的作用:IFNγ可使巨噬细胞表面MHCⅡ类分子的表达增加,增强其抗 原递呈能力;此外还能增强巨噬细胞表面表达Fc受体,促进巨噬细胞吞噬免疫复 原递呈能力;此外还能增强巨噬细胞表面表达Fc受体,促进巨噬细胞吞噬免疫复 合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。 对淋巴细胞的作用:干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂,可受剂量和时间等因素 的影响而产生不同的效应。在抗原致敏之前使用大剂量干扰素或将干扰素与抗原 同时投入会产生明显的免疫抑制作用;而低剂量干扰素或在抗原致敏之后加入干 扰素则能产生免疫增强的效果。在适宜的条件下,IFNγ对 细胞和CD8+T细胞的 扰素则能产生免疫增强的效果。在适宜的条件下,IFNγ对B细胞和CD8+T细胞的 分化有促进作用,但不能促进其增殖。IFNγ能增强TH1细胞的活性,增强细胞免 分化有促进作用,但不能促进其增殖。IFNγ能增强TH1细胞的活性,增强细胞免 疫功能;但对TH2细胞的增殖有抑制作用,因此抑制体液免疫功能。IFNγ不仅抑 疫功能;但对TH2细胞的增殖有抑制作用,因此抑制体液免疫功能。IFNγ不仅抑 制TH2细胞产生IL-4,而且抑制IL-4对B细胞的作用,特别是抑制B细胞生成IgE。 TH2细胞产生IL- ,而且抑制IL细胞的作用,特别是抑制B细胞生成IgE。 对其它细胞的作用:IFNγ对其他细胞也有广泛影响:①刺激中性粒细胞,增强其 对其它细胞的作用:IFNγ对其他细胞也有广泛影响:①刺激中性粒细胞,增强其 吞噬能力;②活化NK细胞,增强其细胞毒作用;③使某些正常不表达MHCⅡ 吞噬能力;②活化NK细胞,增强其细胞毒作用;③使某些正常不表达MHCⅡ类分 子的细胞(如血管内皮细胞、某些上皮细胞和结缔组织细胞)表达MHCⅡ类分子, 子的细胞(如血管内皮细胞、某些上皮细胞和结缔组织细胞)表达MHCⅡ 发挥抗原递呈作用;④使静脉内皮细胞对中性粒细胞的粘附能力更强,且可分化 为高内皮静脉,吸引循环的淋巴细胞。

1.4 重组干扰素的临床应用
广谱抗病毒活性(rhuIFNα) 广谱抗病毒活性(rhuIFNα) 慢性乙型、丙型、丁型肝炎;疱疹、病毒 性角膜炎。 直接抗肿瘤活性(rhuIFNα) 直接抗肿瘤活性(rhuIFNα) 毛细胞和慢性髓样白血病、 Kaposi肉瘤、 Kaposi肉瘤、 非霍奇金淋巴瘤。 免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤 免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤 (rhuIFNγ) rhuIFNγ) 多发性硬化症 rhuIFNβ

1.5.干扰素生产工艺路线(1 1.5.干扰素生产工艺路线(1)
体外诱生干扰素制备工艺: 体外诱生干扰素制备工艺: Sendai病毒诱导人白细胞 Sendai病毒诱导人白细胞 1989年:IFNα-n3/Alferon,批准上市 1989年:IFNα-n3/Alferon,批准上市 产量低:1g IFNα,需要 产量低:1g IFNα,需要 3亿ml人血白细胞 ml人血白细胞 来源困难,工艺复杂,收率低,价格昂贵 潜在的血源性病毒污染的可能性

干扰素生产工艺路线(2 干扰素生产工艺路线(2)
人源转化细胞系培养生产工艺: 人源转化细胞系培养生产工艺: 1999年:IFN α1999年:IFN α-n1/Wellferon, 批准用于临床。 优点:首次实现大规模商业化生产。 缺点: 活性低,退出临床应用。

干扰素生产工艺路线(3 干扰素生产工艺路线(3)
基因工程大肠杆菌发酵生产工艺: 上市产品:重组人干扰素rhuIFN 1986,rhuIFNα-2a, rhuIFNα-2b; 1990,rhuIFNγ-1b;1993,rhuIFNβ-1b; 2001-2002: PEG化IFN,PEG-Intron, Pegasys 表达产物:无糖基化,N-met,无活性包涵体 工艺特点:发酵过程,随后变性、复性过程。

干扰素生产工艺路线(4 干扰素生产工艺路线(4)
动物无限细胞系培养生产工艺: 动物无限细胞系培养生产工艺:

上市产品:rhuIFN β上市产品:rhuIFN β-1a 1996, Avonex(Biogen); 1996, Avonex(Biogen); 2002, 2002, Rebif(Serono) 表达产物:166 表达产物:166 aa 糖基化蛋白,22.5 ku 糖基化蛋白,22.5 工艺特点:分泌表达,产量低,成本高, 工艺特点:分泌表达,产量低,成本高,过 程严格

干扰素生产工艺路线(5 干扰素生产工艺路线(5)
基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺

?宿主:腐生型假单胞杆菌(Pseudomonas putida) 宿主:腐生型假单胞杆菌(Pseudomonas putida) ?上市产品:IFN α-2b/安福隆 上市产品:IFN α-2b/安福隆 ?表达产物:无糖基化可溶性蛋白质,具有天然分子 结构和生物活性 ?工艺特点: 发酵周期短:几个小时 无需变性、复性过程,获得有活性产品 纯化过程:淘汰抗体亲和层析

2. 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏

基因工程假单胞杆菌菌种建立 基因工程假单胞杆菌菌种特性 菌种库的建立与保藏

2.1、基因工程假单胞杆菌菌种建 2.1、基因工程假单胞杆菌菌种建 立

第一步:干扰素α 2b基因的克隆 第一步:干扰素α-2b基因的克隆 第二步:表达载体的构建 第三步:工程菌的构建

第一步:干扰素基因的克隆(RT第一步:干扰素基因的克隆(RT-PCR)
制备白细胞,病毒诱导,分离mRNA,反录酶合成 制备白细胞,病毒诱导,分离mRNA,反录酶合成 cDNA,PCR, cDNA,PCR, 基因连接质粒, 转化E.coli,筛选鉴定克隆。 基因连接质粒, 转化E.coli,筛选鉴定克隆。 测序:编码人IFNα-2b基因序列,501bp,165aa。 测序:编码人IFNα-2b基因序列,501bp,165aa。

第二步: 第二步:表达载体构建
? IFN基因与表达载体连接

? 转化大肠杆菌 ? 筛选阳性克隆 ? 获得序列正确表达载体

第三步:工程菌构建
转化假单胞杆 筛选高表达、稳定遗传的工程菌 获得原始菌种

2.2基因工程菌的特性 2.2基因工程菌的特性
(1)具有宿主菌的特征: 细菌:革兰氏阴性菌,有荚膜,无芽孢,杆 状。 菌落:直径2.5菌落:直径2.5-3.0 mm,灰绿色半透明状,粘 mm,灰绿色半透明状, 稠。 生化特性:Ser生化特性:Ser-,L-Val、D/L-Arg和L-Thr为 Val、D/L-Arg和 Thr为 (2)工程菌的特征:SmR、TcR、ApR )工程菌的特征:SmR、TcR、 (3)具有生产干扰素能力: 放射性免疫学效价不低于2.0× 放射性免疫学效价不低于2.0×109 IU/L。 IU/L。

2.3 菌种库的建立与保藏

? QC:菌种特性、生产能力、质粒稳定性 ? 菌种检查合格后,方可投产。

3 .干扰素α-2b的发酵工艺过程 .干扰素 2b的发酵工艺过程 干扰素α

3.1摇瓶培养 3.1摇瓶培养
取保存工作种子批菌种,室温融化 摇瓶培养:30℃ pH7.0, 摇瓶培养:30℃,pH7.0,250 r/min, r/min, 18±2h 18± 检测:OD值和发酵液杂菌检查。 检测:OD值和发酵液杂菌检查。

3.2 种子罐培养
接种:接入50L种子罐,接种量10%。 接种:接入50L种子罐,接种量10%。 培养:30℃ pH7.0。 培养:30℃,pH7.0。 控制:级联调节通气量和搅拌转速
DO为30%,3~4h,OD>4.0。 DO为30%, 4h,OD>4.0。

检测:显微镜和LB培养基划线检查,控 检测:显微镜和LB培养基划线检查,控 制杂菌。

3.3 发酵罐培养
接种:通入300L培养基的发酵罐,接种量10%。 接种:通入300L培养基的发酵罐,接种量10%。 300L 10% 控制:级联调节通气量和搅拌转速。 前4h:30℃,pH7.0,DO为30%。 4h:30℃ pH7.0,DO为30%。 4h后:20℃,pH6.0,DO为60%,5~6.5h。 4h后:20℃ pH6.0,DO为60%, 6.5h。 终点控制:OD值达9.0±1.0, 终点控制:OD值达9.0±1.0,5℃冷却水快速降 温至15℃ 温至15℃以下。 检测:发酵液杂菌检查

3.4.菌体收集 3.4.菌体收集
连续流离心机:冷却的发酵液,16000 连续流离心机:冷却的发酵液,16000 r/min离心收集。 r/min离心收集。 菌体保存:-20℃冰柜,不超过12个月。 菌体保存:-20℃冰柜,不超过12个月。 检测:干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体 干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。

4 干扰素的分离纯化工艺过程

4.1、干扰素分离工艺过程 4.1、干扰素分离工艺过程

4.2、干扰素的纯化工艺过程 4.2、干扰素的纯化工艺过程

4.1 干扰素α-2b分离工艺过程 干扰素α 2b分离工艺过程
菌体裂解 预处理 初级分离

(1)菌体裂解 (1)菌体裂解

裂解缓冲液:纯化水配制,2 裂解缓冲液:纯化水配制,2℃~10℃ 10℃ (pH7.5) pH7.5) 使用保护剂:EDTA,PMSF。 使用保护剂:EDTA,PMSF。 破碎-20℃菌体:2 破碎-20℃菌体:2厘米以下的碎块 搅拌:加裂解缓冲液,2 搅拌:加裂解缓冲液,2℃~10℃,2hr 10℃ 冻融: 冻融: 细胞完全破裂,释放干扰素。

(2)预处理-沉淀 (2)预处理加絮凝剂聚乙烯亚胺: 加絮凝剂聚乙烯亚胺:
2℃~10℃,搅拌45min,对菌体碎片进行絮凝。 10℃,搅拌45min,对菌体碎片进行絮凝。

加凝聚剂醋酸钙溶液: 加凝聚剂醋酸钙溶液:
2℃~10℃,搅拌15min,对菌体碎片、DNA等进行沉 10℃ 搅拌15min,对菌体碎片、DNA等进行沉 淀。

(3)离心 (3)离心

连续流离心机:2 连续流离心机:2℃~10℃,16000 r/min 10℃ 收集上清液:含有重组干扰素蛋白质 杂质沉淀:121 杂质沉淀:121℃、30min 蒸汽灭菌,焚烧 121℃ 蒸汽灭菌, 处理。

(4)初级分离

盐析: 4M硫酸铵,2 盐析: 4M硫酸铵,2℃~10℃,搅匀,静置过 10℃,搅匀, 夜。 离心:连续流离心机,16000 离心:连续流离心机,16000 r/min 保存:收集沉淀,粗干扰素,4 保存:收集沉淀,粗干扰素,4℃保存。

4.2、干扰素纯化工艺过程 4.2、干扰素纯化工艺过程
溶解粗干扰素 沉淀与疏水层析 阴离子交换层析与浓缩 阳离子交换层析与浓缩 凝胶过滤层析 无菌过滤分装

(1) 溶解粗干扰素
配制纯化缓冲液: 超纯水,pH7.5磷酸缓冲液,0.45 ?m滤器 超纯水,pH7.5磷酸缓冲液,0.45 ?m滤器 和10 ku超滤系统,百级层流下收集。冷却 ku超滤系统,百级层流下收集。冷却 至2℃~10℃。 10℃ 检查: 缓冲液的pH值和电导值。 检查: 缓冲液的pH值和电导值。 溶解: 2℃~10℃,匀浆,完全溶解。 10℃

(2) 沉淀与疏水层析
等电点沉淀(1):磷酸调节至pH5.0,沉 等电点沉淀(1):磷酸调节至pH5.0,沉 淀杂蛋白,离心收集上清液。 疏水层析:干扰素吸附在疏水层析柱中 除非疏水性蛋白

洗脱与收集:0.01M磷酸缓冲液(pH8.0)。 洗脱与收集:0.01M磷酸缓冲液(pH8.0)。

等电点沉淀(2):磷酸调节pH4.5,调节 等电点沉淀(2):磷酸调节pH4.5,调节 电导值40 ms/cm, 电导值40 ms/cm,2℃~10℃,静置过夜 10℃ 超滤:1000 ku超滤膜过滤,除去大蛋白。 超滤:1000 ku超滤膜过滤,除去大蛋白。 透析除盐:调整溶液pH 8.0,电导值,10 透析除盐:调整溶液pH 8.0,电导值,10 ku超滤膜,0.005 M缓冲液。 ku超滤膜,0.005 M缓冲液。

(3)阴离子交换层析与浓缩 (3)阴离子交换层析与浓缩
0.01M磷酸缓冲液(pH8.0)平衡树脂。 0.01M磷酸缓冲液(pH8.0)平衡树脂。 盐浓度线性梯度5 盐浓度线性梯度5~50 ms/cm进行洗脱, ms/cm进行洗脱, 配合SDS-PAGE收集干扰素峰。 配合SDS-PAGE收集干扰素峰。 浓缩:调整溶液和电导,10 ku超滤膜, 浓缩:调整溶液和电导,10 ku超滤膜, 0.05M醋酸缓冲液(pH5.0)中透析。 0.05M醋酸缓冲液(pH5.0)中透析。

(4)阳离子交换层析与浓缩 4)阳离子交换层析与浓缩
用0.1M醋酸缓冲液(pH 5.0)平衡树脂。 0.1M醋酸缓冲液(pH 5.0)平衡树脂。 上样,相同缓冲液冲洗。 盐浓度线性梯度5 盐浓度线性梯度5~50 ms/cm进行洗脱 ms/cm进行洗脱 配合SDS-PAGE收集干扰素峰。 配合SDS-PAGE收集干扰素峰。 浓缩:10 ku超滤膜进行。 浓缩:10 ku超滤膜进行。

(5)凝胶过滤层析 (5)凝胶过滤层析
洗涤液:0.15 NaCl的0.01M磷酸缓冲液 洗涤液:0.15 M NaCl的0.01M磷酸缓冲液 (pH7.0)清洗系统和树脂 pH7.0)清洗系统和树脂 上样,相同缓冲液进行洗脱。 合并干扰素部分

(6)无菌过滤分装 (6)无菌过滤分装
0.22 ?m滤膜过滤干扰素溶液 ?m滤膜过滤干扰素溶液 分装 -20℃以下的冰箱中保存。 20℃

(7)检测项目 (7)检测项目
干扰素鉴别试验 干扰素效价测定 蛋白质含量,纯度测定,分子量 宿主残余蛋白、残余DNA 宿主残余蛋白、残余DNA 干扰素结构鉴定:紫外光谱,肽谱,N 干扰素结构鉴定:紫外光谱,肽谱,N端序 列 其他:热原,内毒素,残留抗生素

相关药物国内生产企业
1,α1b干扰素 1,α1b干扰素 中国预防医学科学院 卫生部长春生物制品研究所 卫生部上海生物制品研究所 深圳科兴生物制品有限公司(赛若金) 2, 人α2a干扰素 卫生部长春生物制品研究所 α2a干扰素 广州医学院 沈阳三生制药股份有限公司(因特芬) 海南新大洲药业有限公司(贝尔芬) 浙江东阳市吴守联合生物技术研究所 深圳科兴生物制品有限公司 武汉天奥制药有限公司(栓剂)

3 人α2b 干扰素 长春生物制品研究所 安徽安科生物高科技有限公司(安达芬) 安徽安科生物高科技有限公司(安达芬) 丽珠集团苏州新宝药厂(隆化诺) 哈尔滨金亚哈尔滨生物制品有限公司(利能) 上海华新生物高技术有限公司 天津华立达生物工程公司 苏州新良药厂 4 人γ干扰素 上海生物化学研究所 中国预防医学科学院 卫生部上海生物制品研究所 第二军医大学 上海克隆生物高技术有限公司 珠海丽珠制药有限公司


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